基因碱基组测序技术手册

2022-02-28 11:30:02 来源：常州皮肤科咨询医生

持续性状物质三组的氨基酸均占总同类型遗传三组氨基酸的1%有将近，但大多将近与疟疾就其的生物体坐落持续性状物质四区。通过持续性状物质三组低通量可断定平均8万个生物体，同类型遗传三组低通量可断定300万个生物体，因此，与同类型遗传三组低通量相较，持续性状物质三组低通量不均费较略高于，将近据库系统阐释也较为直观。持续性状物质三组低通量低效领军以其经济、有效的劣势广泛运用于拉马克持续性状病、罕见病症及精细疟疾的学术研究，并于2010年被Science新闻周刊获评经典作品有所突破之一。

一、低效领军简介

随着社都会日常生活程度的更低，人类身体健康决定性问题也越来越多的受到社都会各界的关注。有别于的持续性状疟疾学术研究方式而是用到显带学术研究、核型学术研究、FISH、持续性状标记、PCR-DNA低通量等有别于试验方法有来寻找与疟疾就其的DNA生物体，这些方法有各有各的特色，但都存在工作量大、效领军略高于、分辨领军略高于等一系列的限制。新一代低通量低通量低效领军的消失，为持续性状疟疾的学术研究提供了同类型新的出发点。

2009年，遗传三组定向逃逸工具的消失使持续性状物质三组低通量成为不太可能。2009年9月，篇关于持续性状物质三组低通量的原理测试者出版文章于Nature新闻周刊上出版。来自华盛顿大学的JayShendure通过对四名Freeman-Sheldon病症病征的持续性状物质三组低通量，找到了已知的免疫遗传MYH3。随后，该团队将这种低效领军运用于史密斯病症的学术研究，通过对病征序列四区氨基酸的逃逸及浅层低通量，断定出单个候选遗传DHODH，并经Sanger低通量测试者其他病征中所存在该遗传的突变。

二、低效领军劣势

• 直接对蛋白序列氨基酸进行时氨基酸测定，找寻冲击蛋白在结构上的生物体。• 低浅层低通量，可断定常见生物体及频领军略高于于1%的罕见生物体。• 同类型面持续性状物质三组范围内低通量，平均占总遗传三组的1%，有效降略高于费、心率、工作量。

三、应该用举举例

疟疾

持续性状方式而

免疫遗传

Freeman-Sheldon病症

MYH3

Kabuki 病症

MLL2

Schinzel-Giedion 病症

SETBP1

Sensenbrenner 病症

WDR35

Fowler 病症

FLVCR2

Perrault 病症

HSD17B4

Hajdu-Cheney 病症

NOTCH2

成骨各有不同类型

SERPINF1

史密斯病症

DHODH

Brown-Vialetto-van Laere 病症

C20orf54

精气磷酸脂酶难免体质不快病症

PIGV

堂兄弟持续性β-三酸甘油酯过少精气症

ANGPTL3

色素持续性视网膜炎

DHDDS

非病症持续性耳聋

GPSM2

原发持续性淋巴管持续性水肿

GJC2

肌萎缩持续性侧莫变硬

VCP

非病症的体质不快

TECR

Van Den Ende-Gupta 病症

SCARF2

自身免疫持续性淋巴三有组织增生症(ALPS)

FADD

小脑共济失调

TGM6

逆向持续性痤疮

NCSTN

四、方案设计

相较有别于低通量，持续性状物质低通量能够迅速的赢得所有持续性状物质范围内的持续性状接收者，在大幅提升效领军的同时显著降略高于了学术研究开销；相较同类型遗传三组低通量，持续性状物质低通量能够在缩短测试心率、减少学术研究量及测试投入的基础上有同类型面持续性的给与大部分同类型遗传三组低通量所能给与的接收者。基于持续性状物质三组低通量良好持续同类产品，该方法有在此之前在当今仍然被广泛的运用于持续性状病和癌症学术研究中所。

1. 单遗传疟疾学术研究方案

首先必须按照疟疾特异持续性对家系核心人物进行时宽松筛查，一致其得病原因并进行时该疟疾学术研究的或多或少调查。在找寻该疟疾仍然有一些学术研究或多或少和就其的免疫遗传报道，可通过有别于PCR低通量方法有对已知的疟疾就其生物体进行时测试者和初筛；测试者所学术研究的采样中所未断定就其的遗传生物体，那么可以选定一个或将近个不同疟疾家系的核心人物核心人物进行时持续性状物质三组低通量。每个家系中所的得病变异选定出3-5个采样，短时间变异选定出1-2名作为对应该进行时学术研究。按照疟疾模型(AD，AR等)及样品的家系接收者对低通量给与的结果进行时学术研究，缩小候选生物体的范围内，经难免种评注、选取后过滤掉对特持续性无冲击的生物体及公共将近据库系统库中所的常见生物体，再用到有别于PCR低通量进行时采样定性测试者及就其的特持续性学术研究，终一致疟疾就其生物体。

单遗传持续性状病学术研究举举例：

a．家系图：

b．学术研究出发点：1). 隐持续性纯合突变免疫：两个病征共享不同的纯合突变，父母为杂合携带者。2). 举举例来说杂合突变免疫：两个病征不具不同的突变，即在一个遗传留有两个各有不同的杂合生物体，而父母分作这两个杂合突变的携带者。3). 显持续性方式而（新生突变）：找两个病征共有的杂合突变，而父母不带有该突变。

c．学术研究结果示意：

若采样为散发采样，由于采样除此以外没有精气缘关系，持续性状或多或少差距很小，低通量给与的结果也较难学术研究。为了较为可靠的给与有价绝对值的结果，用到散发采样进行时持续性状物质三组低通量要求的采样比例比家系采样要多一些。一般要求至少做30个得病变异采样以上的平行低通量学术研究。对大量得病变异的低通量将近据库系统进行时多采样学术研究，从而一致候选疟疾就其生物体，再用有别于PCR低通量在其他的不同疟疾得病变异和短时间许多人中所做进一步测试者。

2. 精细疟疾及癌症的学术研究方案

对于精细疟疾，首先应该该可选择不具持续性状持续性低的病举例作为学术研究对象，一般必须实现表列几个特色：a.与疟疾就其；b. 离地持续性状；c. 在病征中所发挥较要到，特异持续性一致，低外显领军；d.疟疾的得病系统相似。整体的学术研究出发点一般是通过适时采样的持续性状物质低通量(得病和身体健康变异各50举例)找到与疟疾离地联系的略高于频突变，然后根据这一结果订制合适的芯片，在大采样里进行时大规模测试者。从而赢得精确度更低的疟疾就其生物体位点。接着可以针对这些位点进行时生物学特持续性学术研究，从而给与有意义的结果，开发出疟疾诊断及治疗的就其的产品等。

在各种诱发的作用下，机体某些体肝细胞基因上发生的生物体毁损或改变了某些重要的生物学操作过程，体肝细胞不太可能都会因此异常增生而转变为肝细胞。由于肝细胞不具异质持续性，同小块三有组织里不太可能带有各有不同时期的肝细胞以及短时间体肝细胞，因此它的遗传生物体原因一般来说其持续性状疟疾来说较为精细。对于三有组织的持续性状物质三组低通量学术研究，其决定性的处理过程在于采样的选定出。在此之前常见的原因是分别取同一癌症病征的癌三有组织和癌旁三有组织进行时比较，采样比例要求至少20对以上。低通量后成对的采样进行时学术研究后再进行时各有不同病人除此以外的多采样学术研究，以此来掘出就其的遗传生物体。由于归因于的原因以外遗传突变，遗传表达程度生物体，表观持续性状生物体等多个特别，在利用NGS学术研究的时候，通常都会用到多种试验方法有相结合的方法有，举例如转录三组低通量、同类型遗传三组低通量、甲基化低通量等，相互进行时印证，多将近据库系统拆分学术研究可以进一步的更低将近据库系统的可靠持续性，提升科研出版文章档次。

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五、逃逸的平台

在此之前主流的逃逸的平台，各的平台的特色如下。

逃逸的平台

Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit

Roche SeqCap EZ Human Exome Library

Agilent SureSelect Human All Exon

逃逸量

62M

64M

51M

逃逸范围内

持续性状物质及旁翼四区，

部分UTR及miRNA

持续性状物质四区及miRNA

持续性状物质四区

探针

95 mer DNA

90-105 mer DNA

120 mer RNA

探针将近量

340,427

2,100,000

655,872

对常用将近据库系统库的覆盖领军

97.2% CCDS

96.4% RefSeq

93.2% Gencode

77.6% miRBase

99.8% CCDS

98.4% RefSeq

96.7% Gencode

98.67% miRBase

1.22% of human genomic regions，

> 700 human miRNAs，

> 300 additional human non-coding RNAs

六、项目流程

1、采样探测

用于建库的DNA样品标准为样品浓度等于60ng/μl，体积等于20μl，OD260/OD280为1.7-2.0。通过表列三种方式进行时采样探测：

• 用到红外定量的方法有对DNA样品进行时定量；• NanoDrop探测OD260/OD280；• 凝胶电泳探测DNA的状态，是包含蛋白质、RNA污染及是否存在DNA降解。 2、建库

应该用TruSeq DNA Sample Prep Kits进行时文库合成，起始DNA量为1.2 μg。

3、逃逸

以Illumina的逃逸的平台为举例，应该用TruSeq Exome Enrichment Kit逃逸持续性状物质三组及旁翼四区，部分UTR及miRNA，总逃逸范围内为62M。

4、低通量

逃逸给与的DNA氨基酸可于Illumina的任一低通量仪中所进行时低通量，以HiSeq2000为举例，每run可试运行两张flowcell，每个flowcell以外8个lane，100PE方式而下每run试运行平均11天，将近据库系统生产量为600G。逃逸样品经桥式PCR后，放置flowcell中所进行时低通量，持续性状物质三组采样一般要求低通量125X，便足够进行时持续性状疟疾学术研究，如采样可根据原因适度增加低通量浅层。

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5、质控

宽松用到Illumina原厂试剂，遵循Illumina GenomeNetwork管理，是Illumina同类型球低低通量总质量的推选。平之外等于99% 双链可靠度达Q20，必需等于85%双链可靠度达Q30，平之外clean data占总raw data 90% 以上。对于持续性状物质三组项目，平均90%的持续性状物质范围内覆盖度达到10×以上，必需低的低通量之外一持续性。

a．原始将近据库系统

HiSeq 2000的平台生产量的原始将近据库系统为FastqXML，表列是对该XML的详细暗示：

@HWI-ST1203:231:C1NDLACXX:7:1101:1837:2139 1:N:0:AGTCAATTCCACTTAAAAATACAAGAGCACAAATCCACATTTATTTATTGATTTTTCGTTAGTTTAAATCCTTGAGGGGTACAGCATCACTCGGATTCTGTGTCCAA+CCCFDFFFHHHHHJJJJIJJJJJJJJIJIJIJFHJJGJEIEIGIIJIJIIGIDGGIIHI@HHEHIIIIIJ=CHABBDFFFFEEDEEDBBDDCDDCCDDCDC

对于以上Fastq氨基酸，字句以@开头，后面是read的ID以及其他接收者；第二行推选read的氨基酸；第三行一般以“+”表示；第四行推选read的总质量接收者，与第二行的双链氨基酸一般来说应该。其中所，为了便于计算机进行时打印，总质量绝对值以个字符来表示，每个个字符所推选的ASCII码倍将近33即为该双链对应该的总质量绝对值。根据其所的公式（Q=-10lgP），即可计算每个双链被测错的概领军，其中所Q20推选双链被测错的概领军为1%，Q30推选双链被测错的概领军为1‰。

将以上Fastq氨基酸的总质量接收者转化其所的总质量绝对值，结果如下。在该read中所，只有一个双链的总质量绝对值为28，其余双链的总质量绝对值之外等于30。34，34，34，37，35，37，37，37，39，39，39，39，39，41，41，41，41，40，41，41，41，41，41，41，41，41，40，41，40，41，40，41，37，39，41，41，38，41，36，40，36，40，38，40，40，41，40，41，40，40，38，40，35，38，38，40，40，39，40，31，39，39，36，39，40，40，40，40，40，41，28，34，39，32，33，33，35，37，37，37，37，36，36，35，36，36，35，33，33，35，35，34，35，35，34，34，35，35，34，35，34.

b．总质量评估

双链总质量评分

如图所示是遗传低通量给与read的总质量绝对值结果，其中所几乎所有双链的总质量绝对值在20以上，90%以上双链的总质量绝对值在30以上。

低通量浅层分布

虽然持续性状物质三组低通量的整体浅层一般都等于100X，但由于低通量操作过程中所存在一定的氨基酸相对于持续性，部分持续性状物质范围内的低通量覆盖度较略高于。在进行时接收者学术研究时，通常只考虑低通量浅层略高于10X的持续性状物质范围内，以便更低学术研究结果的可靠持续性。低通量结果中所，85%-95%的持续性状物质范围内低通量浅层等于10X，必需低的低通量之外一持续性。

c．结果展示

英文常量

统计将近据库系统结果

中所文暗示

Sample Name

Example

采样名

Total reads

100,256,834

Reads比例

Total yield (bp)

10,125,940,234

比特领军

Read length (bp)

101.0

读长

Target regions (bp)

62,085,286

大限度范围内微小

Average throughput depth of target regions

163.1

平之外低通量浅层

Initial mappable reads (mapped to human genome)

100,097,762

可比对氨基酸将近

% Initial mappable reads (out of total reads)

99.8%

可比对氨基酸比重

Non-redundant reads (de-duplicated by Picard tools)

82,401,028

非延时氨基酸将近

% Non-redundant reads (out of initial mappable reads)

82.3%

非延时氨基酸比重

Non-redundant unique reads (uniquely mapped to human genome)

73,028,083

非延时单一比对氨基酸将近

% Non-redundant unique reads (out of non-redundant reads)

88.6%

非延时单一比对氨基酸比重

On-target reads (mapped to target regions)

50,349,303

大限度范围内氨基酸将近

% On-target reads (out of non-redundant unique reads)

68.9%

大限度范围内氨基酸比重

% Coverage of target regions (more than 1X)

95.1%

低通量浅层等于1×的覆盖度

Number of on-target genotypes (more than 1X)

59,032,909

低通量浅层等于1×的范围内

% Coverage of target regions (more than 10X)

91.6%

低通量浅层等于10×的覆盖度

Number of on-target genotypes (more than 10X)

56,865,579

低通量浅层等于10×的范围内

Mean read depth of target regions

65.4

大限度范围内平之外低通量浅层

Number of SNPs

78,241

SNP比例

Number of coding SNPs

20,593

序列四区SNP比例

Number of synonymous SNPs

10,654

均指SNP比例

Number of nonsynonymous SNPs

9,391

非均指SNP比例

Number of Indels

8,447

InDel比例

Number of coding Indels

411

序列四区InDel比例

6、接收者学术研究

a. 一致氨基酸，原始将近据库系统过滤及统计将近据库系统：通过FastQC， FastX-toolkit等软件对低通量总质量进行时评估，移除略高于总质量reads(等于5个双链总质量略高于于Q20)，剩余的将近据库系统作为clean data进行时学术研究，平之外等于99%的双链总质量略高于Q20，等于85%的双链总质量略高于Q30。b. Mapping：通过bwa软件将reads map到标准参考资料遗传三组上(UCSC hg19)，移除无法map到参考资料遗传三组和多重map的reads后进行时后续学术研究，大平均有99.5%的reads能进行时下一轮学术研究。c. 移除不同reads(duplicate reads)：持续性状物质逃逸操作过程中所带有PCR倍增处理过程，都会人为过渡到不同的DNA片段，由于这些DNA氨基酸都会对前期的学术研究造成冲击，故要用到PICARD软件移除将近据库系统中所的duplicate reads，各有不同的逃逸的平台中所这类氨基酸所占总的比重不一样，illumina逃逸的平台中所的duplicatereads比例平均占总总将近据库系统的15-20%，Agilent的平台中所的这一将近绝对值平均为1-3%。d. 对大限度范围内内的氨基酸进行时生物体带有：用到Samtools对低通量结果与参考资料遗传三组进行时比对，找寻样品中所存在的生物体，以外SNV，InDel等，并对其进行时评注及特持续性预测，以外dbSNP、1000G将近据库系统库，SIFT，Polyphen-2，GERP等软件。e. 多采样学术研究：根据学术研究段落的各有不同，将多个采样细分各有不同的三组别，对其中所的生物体接收者进行时汇总，统计将近据库系统生物体在社会变迁性内消失的频领军，后方等就其接收者，通过KEGG等信号通路评注学术研究其与疟疾之除此以外的联系。f. 调查结果草拟：以外样品探测与建库调查结果(pdfXML)、低通量结果调查结果(pdfXML)、单采样生物体带有调查结果(excelXML)、多采样汇总学术研究调查结果(excelXML)、原始将近据库系统(fastq、BAM等XML)和出版出版文章所需的各类图表。

七、持续性状物质三组低通量就其名词

持续性状物质三组低通量：是均指利用氨基酸逃逸低效领军将同类型遗传三组持续性状物质范围内DNA捕捉并富集后进行时低通量低通量的遗传三组学术研究方法有。持续性状物质低通量一般来说于遗传三组重低通量开销较略高于，对学术研究已知遗传的SNP、 InDel 等不具很小的劣势。

低通量浅层：低通量给与的总双链将近与待测范围内微小的比绝对值。如用到Illumina TruSeq Exome Enrichment Kit，该试剂盒的逃逸范围内为62M，低通量给与620M比特领军时，低通量浅层为620/62=10×。

覆盖度：均指低通量赢得的氨基酸占总整个待测范围内的比重。如果持续性状物质三组低通量的覆盖度是98%，则表示仍有2%的氨基酸范围内是没有通过低通量赢得的。

Read：就是读长，就是低通量低通量时一个反应该所能测出的双链将近。

SNP（single nucleotide polymorphism）：单核苷酸多态持续性，变异除此以外遗传三组DNA氨基酸同一后方单个核苷酸生物体(替代、接在或缺少)所造成了的多态持续性；各有不同物种变异遗传三组 DNA 氨基酸同一后方上的单个核苷酸存在差异的现象。 InDel（Insertion/Deletion）：接在/缺少，是均指两种亲本在同类型遗传三组中所的差异，一般来说另一个亲本而言，其中所一个亲本的遗传三组中所有一定将近量的核苷酸接在或缺少。 CNV（copy number variation）：遗传三组拷贝将近生物体，是遗传三组生物体的一种基本，通常使遗传三组中所广袤段的DNA形成非短时间的拷贝将近量。 SV（structurevariation）：遗传三组在结构上生物体，基因在结构上生物体是均指在基因上发生了广袤段的生物体。主要以外基因广袤段的接在和缺少（造成了 CNV的变化），基因内部的某块范围内发生重复解码、翻滚颠换、易位、两条基因之除此以外发生重三组（inter-chromosometrans-location）等。

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